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Kundenspezifische qPCR und dPCR Sonden

 
 

Erhöhen Sie die Sensitivität und Spezifität Ihrer real-time oder digitalen PCR mit Sonden von Microsynth. Hochwertige qPCR und dPCR Sonden mit einer breiten Palette an Farbstoffen und Quenchern werden mit ausserorderntlicher Geschwindigkeit geliefert.

 

Features and Benefits

 
 
Höchste Qualität
  • Gründliche Aufreinigungsprozesse (HPLC oder sogar PAGE)
  • Strenge Qualitätskontrolle (Online-Trityl-Monitoring und MALDI-TOF MS)
 
Sehr schnelle Produktionszeiten
  • durchschnittlich innerhalb von 3 Arbeitstagen
 

Benutzerfreundliches Online-Bestellsystem

  • Neues und einfach zu bedienendes Online-Portal mit einer Reihe von hilfreichen Tools (z.B. Auftragsverfolgung & Historie, komfortable Suche und Nachbestellmöglichkeit)

 
 
Umfassendes Leistungsangebot
  • Dual-labeled Probes mit einer breiten Palette von Farbstoffen und Quenchern
  • Double-quenched probes für reduzierten Hintergrund und erhöhte Endpunktsfluoreszenz
  • Molecular beacons und FRET Sonden
  • Tm-verstärkende Basen als Alternativen für MGB und LNA
  • Kostenloser Design-Service
  • Assay-Validierung über die PCR-Abteilung von Microsynth möglich

 

Hervorragender Technischer Support
  • Ausgebildete Wissenschaftler mit molekularbiologischem Hintergrund unterstützen Sie gerne (von 8 Uhr bis 17 Uhr)!
 

Dual-Labeled Probes

TaqMan probe

 

Die sogenannten TaqMan-Sonden sind Hydrolyse-Sonden, die die Spezifität der quantitativen PCR erhöhen sollen.

Im hybridisierten Zustand reicht die Nähe des Fluorophors und des Quenchers aus, um die Fluoreszenz zu quenchen. Während der PCR wird die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase genutzt, um die doppelt markierte Sonde zu spalten. Dabei werden der Fluorophor und der Quencher getrennt und ein Fluoreszenzsignal ermöglicht eine quantitative Messung.

Durch die TaqMan-Sonde wird die Spezifität des Nachweises deutlich erhöht .

Wir unterstützen Sie gerne beim Design der Sonden und der dazugehörigen Primer.

 
 
Minimale und durchschnittliche Ausbeuten für dual-labeled Sonden von Microsynth
5‘ Label 3‘ Label 0.04 µmol scale1 0.2 µmol scale1 1.0 µmol scale1
Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2,3 Average yield2
FAM TAMRA 1 OD
5 nmol
3 OD
15 nmol
2 OD
10 nmol
8 OD
40 nmol
10 OD
50 nmol
30 OD
150 nmol
BHQ-1 9 OD
45 nmol
8 OD
40 nmol
25 OD
125 nmol
HEX
TET
TAMRA n/a n/a 2 OD
10 nmol
8 OD
40 nmol
10 OD
50 nmol
30 OD
150 nmol
AlexaFluor 350
FAM
HEX
TET
Dabcyl n/a n/a 2 OD
10 nmol
5 OD
25 nmol
10 OD
50 nmol
20 OD
100 nmol
AlexaFluor 350
HEX
JOE
TET
ATTO 425/532
Yakima Yellow
(equivalent to VIC)
BHQ-1 n/a n/a 1.5 OD
7.5 nmol
6 OD
30 nmol
8 OD
40 nmol
25 OD
125 nmol

ATTO 647N
ATTO 620
ATTO 550
(equivalent to NED)
Cy3/Cy5
Dyomics 681
ROX
TAMRA
Texas Red
CalRed
(equivalent to Texas Red)

BHQ-2 n/a n/a 1.5 OD
7.5 nmol
4 OD
20 nmol
8 OD
40 nmol
15 OD
75 nmol

1 Der Synthesemassstab stellt die Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial) dar
2 Ausbeuten, die in OD260 angegeben sind, gelten für eine Sonde, die aus 20 DNA-Basen besteht; Kalkulation: 1 OD = 5 nmol (bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 DNA-Basen basiert; sie kann bei Sequenzen mit hohem GC-Gehalt >70% etc. abweichen)
3 Für PAGE-gereinigte Sonden im 1,0 umol Synthesemassstab beträgt die garantierte Ausbeute 5 OD

 

Double-Quenched Probes

 

Die üblichen qPCR Sonden für 5'-Nuklease-Assays haben einen Fluorophor am 5'-Ende und einen geeigneten Quencher am 3'-Ende, der einerseits die Fluoreszenz des Farbstoffs löscht und andererseits die Verlängerung der Sonde während der qPCR-Reaktion verhindert. Bei längeren Sonden und damit einem größeren Abstand zwischen Fluorophor und Quencher steigt der Hintergrund oft in einem unerwünschten Maße an.

Doppelt gequenchte Sonden reduzieren den Hintergrund und erhöhen die Sensitivität. Durch den Einbau eines zusätzlichen Quenchers in die Sequenz in der Nähe des 5'-Fluorophors kann eine deutliche Verbesserung der Ergebnisse erzielt werden.
Der neue Quencher IQ-500 mit einem Absorptionsmaximum von ca. 500 nm und einem Quenching-Bereich von ca. 450 nm bis 550 nm ist als 3'- und interne Modifikation konzipiert.

Doppelt gequenchte Sonden enthalten ein 5'-FAM-Fluorophor, einen 3'-BHQ-1-Quencher und einen internen IQ-500-Quencher in einem Abstand von 8-10 Basen zum Fluorophor.

Wir unterstützen Sie gerne beim Design der Sonden und der dazugehörigen Primer.

 
Minimale und durchschnittliche Ausbeuten für doppelt gequenchte Sonden von Microsynth
5‘ Label 3‘ Label 0.04 µmol scale1 0.2 µmol scale1 1.0 µmol scale1
Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2
FAM IQ-500 with BHQ-1 or TAMRA n/a n/a 2 OD
10 nmol
8 OD
40 nmol
8 OD
40 nmol
25 OD
125 nmol

1 Der Synthesemaßstab bezeichnet die Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial).

2 Die in OD260 angegebenen Ausbeuten gelten für eine Sonde, die aus 20 DNA-Basen besteht; Berechnung: 1 OD = 5 nmol (bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 DNA-Basen basiert; sie kann bei Sequenzen mit hohem GC-Gehalt >70% etc. abweichen)

 

Mögliche Anwendungen

  • Anspruchsvolle qPCR-Anwendungen mit Bedarf an größerer Flexibilität im Sequenzdesign, z. B. für Targets, die AT-reich sind und längere Sonden (≥25 Basen) erfordern
  • ddPCR-Analysen, bei denen die doppelt gequenchte Sonde die Unterscheidung von positiven vs. negativen Tröpfchen erleichtert (verbesserte Clusterbildung)

LNA Probes


Locked Nucleic Acid (LNA) hat sich als leistungsfähiges Werkzeug in vielen qPCR- und digitalen PCR-Anwendungen erwiesen. Wenn sie in DNA-Oligonukleotide eingebaut werden, bieten die resultierenden LNA-haltigen Oligonukleotide folgende Hauptvorteile im Vergleich zu reinen DNA-Basen im nativen Zustand:

  • Erhöhte thermische Stabilität und Hybridisierungsspezifität
  • Genauere Genquantifizierung und allelische Diskriminierung
  • Leichtere und flexiblere Designs für problematische Zielsequenzen

Jede LNA-Base, die in einem Oligo hinzugefügt wird, erhöht die Tm um ca. 2-4 °C. Gesperrte Nukleinsäuresonden können so entworfen werden, dass sie eine ΔTm von >15°C haben. Üblicherweise werden nicht mehr als 5 LNA-Basen in eine Sondensequenz eingebaut. Bitte beachten Sie beim Design und der Optimierung Ihrer LNA-Sonden die hier beschriebenen Richtlinien.

Bei Microsynth können Sie Ihre LNA-Sonde mit der gesamten Palette an Farbstoffen und Quenchern bestellen, die wir auch für unsere dual gelabelten Sonden anbieten.

 

Molecular Beacons

 
Molecular Beacons sind einzelsträngige Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, die eine Stem-and-Loop-Struktur bilden. Die Schleife enthält eine Sondensequenz, die komplementär zu einer Zielsequenz ist, und der Stamm wird durch das Annealing von komplementären Armsequenzen gebildet, die sich auf beiden Seiten der Sondensequenz befinden. Daher befinden sich ein Fluorophor am 5'-Ende und ein Quencher am 3'-Ende in unmittelbarer Nähe und fluoreszieren nicht. Wenn sie jedoch an einen Nukleinsäurestrang hybridisieren, der eine Zielsequenz enthält, erfahren sie eine Konformationsänderung, die sie hell fluoreszieren lässt.

MGB Probes

 
Microsynth bietet jetzt kundenspezifische, qualitativ hochwertige MGB-Sonden für R&D-Zwecke zu erschwinglichen Preisen an.
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DNA-Sonden, die mit Minor Groove Binder (MGB) konjugiert sind, bilden außergewöhnlich stabile Duplexe mit einzelsträngigen DNA-Targets, wodurch kürzere Sonden für Hybridisierungs-basierte Assays verwendet werden können.
 
Daher bietet eine MGB-Sonde folgende Vorteile gegenüber herkömmlichen einfach oder doppelt gequenchten Sonden: 
- höhere Selektivität der Zielbindung
- geringere Hintergrundfluoreszenz
- höhere Qualität der Sonde aufgrund der kürzeren Länge
 
Wichtigste Vorteile
 
- Lieferung von hohen Durchschnittsausbeuten
- Produktion innerhalb von durchschnittlich 4 Arbeitstagen 

Portfolio of MGB Probes

Minimale und durchschnittliche Ausbeuten für MGB-Sonden von Microsynth
5‘ Label 3‘ Label 0.04 µmol scale1 0.2 µmol scale1 1.0 µmol scale1
Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2
FAM MGB-Q530
1 OD
5 nmol
3 OD
15 nmol
2 OD
10 nmol
8 OD
40 nmol
10OD
50 nmol
30OD
150 nmol
JOE MGB-Q530
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request
Yakima Yellow MGB-Q530
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request
HEX MGB-Q530
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request
on
request

1 Der Synthesemassstab entspricht der Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial).

2 Die in OD260 angegebenen Ausbeuten gelten für eine Sonde, die aus 20 DNA-Basen besteht; Berechnung: 1 OD = 5 nmol (bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 DNA-Basen basiert; sie kann bei Sequenzen mit hohem GC-Gehalt >70% etc. abweichen)

 

Kostengünstige Alternative
Darüber hinaus bietet Microsynth den kostengünstigen 3' MGB-Q500 Quencher-Anteil an. Dieser Quencher ist nur mit FAM als Reporterfarbstoff erhältlich.
 
5‘ Label 3‘ Label 0.04 µmol scale1 0.2 µmol scale1 1.0 µmol scale1
Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2 Minimum yield2 Average yield2
FAM MGB-Q500
1 OD
5 nmol
3 OD
15 nmol
2 OD
10 nmol
8 OD
40 nmol
10OD
50 nmol
30OD
150 nmol
1 The synthesis scale represents the initial amount of 3' bases (starting material).

2 Yields indicated in OD260 apply to a probe consisting of 20 DNA bases; Calculation: 1 OD = 5 nmol (please note that this calculation is based on sequences with virtually homogenous distribution of the 4 DNA bases; it may vary for sequences with high GC contents >70% etc.)

Design Service

 
Designs mit geringer Komplexität

Dual-Labeled Probe Assays sind die gängigsten im Bereich der Real-Time PCR. Dual-Labeled Probe Assays sind in der Regel spezifischer als SYBR Green Assays. Das Einrichten eines sondenbasierten Assays erfordert auch weniger Optimierungsschritte und die Analyseergebnisse sind einfacher zu interpretieren. Durch die Verwendung von gut konzipierten, qualitativ hochwertigen Sonden in Ihrer Analyse reduzieren Sie die Kosten für die Assay-Optimierung und mögliche Fehlerkorrekturen und Wiederholungen Ihrer Messungen im Vergleich zu SYBRGreen-Assays, wodurch Ihre Analyse schneller und kostengünstiger wird.

Aufgrund der Verfügbarkeit verschiedener kostenloser Online-Software-Tools ist ein gutes Assay-Design für einen Singleplex-Assay mit einer doppelt markierten Sonde (auch Hydrolyse- oder TaqMan-Sonde genannt) einfach durchzuführen und erfordert keine detaillierten Kenntnisse (es reicht aus, die folgenden key design guidelines zu beachten).

Microsynth kann die folgenden Design-Tools empfehlen, die es einfach machen, hochgradig angepasste Primer und dual-markierte Sonden für Routine-qPCR-Anwendungen zu entwerfen:

  • Primer-BLAST

    Primer-BLAST wurde am NCBI entwickelt, um den Benutzern zu helfen, Primer zu erstellen, die spezifisch für das beabsichtigte PCR-Ziel sind. Es verwendet Primer3, um PCR-Primer zu entwerfen und verwendet dann BLAST und den globalen Alignment-Algorithmus, um Primer gegen die vom Benutzer ausgewählte Datenbank zu screenen, um Primer-Paare zu vermeiden (alle Kombinationen einschließlich Vorwärts-Rückwärts-Primer-Paare, Vorwärts-Vorwärts- sowie Rückwärts-Rückwärts-Paare), die unspezifische Amplifikationen verursachen können. Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S, Madden T (2012). Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13:134.

  • Primer3Plus

    Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386

 

Komplexere Designs (auf Anfrage)

Bei der Planung von Experimenten, die komplexere Überlegungen zum Assay-Design erfordern, wie z. B. spleißspezifische, Multiplexing-, SNP- und CNV-Designs oder spezielle Chemie (LNA/MGB/Propynyl), können Sie sich auf die Erfahrung von Microsynth auf diesem Gebiet (>2 Jahrzehnte) sowie auf ausgewählte professionelle Design-Tools für solche anspruchsvollen Anwendungen verlassen.
Wenn Sie zusätzliche Unterstützung beim Design von Primern und Sonden benötigen, kontaktieren Sie uns unter myproject@microsynth.ch. Bitte vergessen Sie nicht, die folgenden Punkte anzugeben:

  • Experimentelles Ziel (Expressionsanalyse, Erregernachweis, etc.)
  • Akzessionsnummer(n) oder alternativ die Gensequenzen Ihres Targets
  • Gewünschter Synthesemaßstab sowie 5'- und 3'-Labels

 

 

Wie bestellen

 

  • Besuchen Sie unseren Webshop
  • Klicken Sie auf DNA im Bereich "DNA/RNA Synthesis"
  • Wählen Sie entweder "Normal Entry", um die gewünschten Sequenzinformationen etc. einzutippen oder zu kopieren/einzufügen, oder wählen Sie alternativ "Upload Entry" unter Verwendung unserer praktischen Excel-Vorlage (kann bei der Bestellung heruntergeladen werden)
  • Single-quenched probes (TaqMan, Molecular Beacon, MGB and LNA probes): Wählen Sie die gewünschte 5'- und 3'-Modifikation sowie die HPLC-Aufreinigung1, und Ihr Oligo wird als single-quenched probe erkannt und verarbeitet.
  • Bei LNA Sonden fügen Sie die Ordnungssymbole "5, 6, 7 und 8" in Ihre Sequenz ein und wählen unter "Innere Modifikation (5=...)" "LNA-A, LNA-C, LNA-G und LNA-T" usw.
  • Double-quenched probes: Fügen Sie das Ordnungssymbol "5" in Ihre Sequenz ein (z.B. catattgaa5actgggttaacggaatt) und wählen Sie unter "Innere Modifikation (5=...") "Internal Quencher 500". Wählen Sie Ihre gewünschte 5'-, 3'-Modifikation sowie die HPLC-Aufreinigung aus, und Ihr Oligo wird als doppelt gequenchte Sonde erkannt und prozessiert.
  • Folgen Sie den weiteren Anweisungen

1 Microsynth liefert qPCR-Sonden von höchster Qualität. Der Großteil der Microsynth qPCR-Sonden wird mittels HPLC aufgereinigt, während einige wenige eine PAGE-Aufreinigung benötigen, um die strengen QC-Spezifikationen zu erfüllen. Wenn Ihre Farbstoff/Löscherkombination nicht mit HPLC kompatibel ist, verwenden Sie einfach PAGE.