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Aufreinigung

 
 
Oligonukleotide werden mittels Festphasensynthese assembliert. Dabei werden die Nukleotide entsprechend der gewünschten Sequenz angehängt, was zu einem Kettenwachstum führt. Es ist allgemein bekannt, dass bei chemischen Reaktionen nie eine 100%ige Umsetzung erreicht wird. Bei der Oligonukleotidsynthese nach dem Stand der Technik werden Kopplungsausbeuten von 99,5% erreicht. Bei den nicht umgesetzten 0,5 % der Stränge kommt der Kettenaufbau zum Stillstand und es bilden sich verkürzte Sequenzen als Nebenprodukte.
Je nach Anwendungszweck ist es vorteilhaft, diese kürzeren Sequenzen aus dem Volllängenprodukt zu entfernen. Daher bietet Microsynth verschiedene Arten von Aufreinigungsmethoden an.

Übersicht

Desalted

Alle unsere Oligos werden zumindest entsalzt, um restliche niedermolekulare Nebenprodukte, die bei den häufigen chemischen Reaktionen während der Synthese entstehen und sich anreichern, weitgehend zu entfernen. Eine solche Reinigung ist ausreichend für Oligonukleotide, die kürzer als 30 sind und/oder Oligonukleotide, die für unkritische Anwendungen wie PCR, Sequenzierung, Sondierung, Mobilitätsverschiebung oder Hybridisierung verwendet werden. Für die Verwendung in molekularen Klonierungsprojekten werden entsalzte Oligos jedoch nicht empfohlen.

Mögliche Anwendungen:

  • PCR
  • DNA-Sequenzierung
  • Sondierung
  • Mobilitätsverschiebung oder Hybridisierung

 

HPLC Purification

Oligos mit einer Länge von <50 Basen können über Reverse Phase HPLC gut aufgereinigt werden. Durch diesen Aufreinigungsansatz werden vorzugsweise restliche, n-x-verkürzte Oligos (denen die hydrophobe DMT-Schutzgruppe am 5'-Ende fehlt) entfernt. Dies führt zu einer ≥85%igen Reinheit des gewünschten Oligonukleotids. RP-HPLC ist nützlich für einen höheren Reinheitsgrad, der für anspruchsvollere Anwendungen wie Klonen, DNA-Fingerprinting, Echtzeit-PCR, FISH usw. erforderlich ist.

Mögliche Anwendungen:

  • Molekulare Klonierung
  • DNA-Fingerprinting
  • Real-Time PCR und digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR)*
  • FISH

 

* Microsynth Primer und qPCR-Sonden sind mit allen kommerziell erhältlichen Supermixes kompatibel

HPLC Purification & Dialysis

Die Dialyse als Zusatz zur HPLC wird empfohlen, wenn die Oligos in einem physiologischen Zustand vorliegen müssen. Bei der Durchführung von in vivo Experimenten (z. B. in Mäusen) wird dieser Reinheitsgrad dringend empfohlen.

Mögliche Anwendungen:

  • Antisense-Experimente
  • Zellkultur-Studien
  • Physikalische Chemie und Strukturanalyse (NMR, MS etc.)

 

PAGE Purification

Die Aufreinigung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist generell für lange Oligos (>50 Basen) und für all jene Primer mit kritischen 5'-Sequenzen (Restriktionsendonuklease-Stellen, RNA-Promotoren) notwendig. Es ist die beste Methode zur Unterscheidung von Oligos in voller Länge von abgebrochenen Sequenzen (n-1 Oligos), basierend auf Größe, Konformation und Ladung. Die PAGE-Aufreinigung hat eine exzellente Auflösung und liefert ein Produkt, das im Durchschnitt ≥95% rein ist. Dabei ist zu beachten, dass der Reinheitsgrad mit zunehmender Länge des Oligonukleotids abnimmt, was insbesondere für Oligos bis zu 120 Basen gilt. Die PAGE-Reinigung wird für sensible Experimente wie Klonierung, Mutagenese, DNA-Fingerprinting, in situ Hybridisierung, Gensynthese, etc. sehr empfohlen.

Mögliche Anwendungen:

  • Molekulare Klonierung
  • Mutagenese
  • DNA-Fingerprinting
  • In-situ-Hybridisierung
  • Gensynthese

 

DNA Ausbeuten

 
Desalted DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics 13 - 60 2 10 8 40 1
0.04 µmol 13 - 80 3 15 9 45 1
0.2 µmol 6 - 1504 10 50 20 100 1
1.0 µmol 6 - 80 50 250 80 400 1
15 µmol 13 - 60 700 3‘500 1000 5000 2
 
HPLC Purified DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol <51 1 5 4 20 2
0.2 µmol 3 15 7 35 2
1.0 µmol 15 75 26 130 2
15 µmol 300 1'500 500 2500 4
 
HPLC Purified & Dialysed DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol

<51

3 15 6 30 3
1.0 µmol 15 75 20 100 3
15 µmol 200 1'000 400 2000 4
 
PAGE Purified DNA Oligos
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 13-80 0.5 2.5 6 30 2
0.2 µmol 8-80
81-1504
2
0.5
10
2.5
8
4
40
20
2
1.0 µmol 8-80 7 35 20 100 2
15 µmol not available

 

1 Der Synthesemassstab entspricht der Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial).
2 Garantierte und durchschnittliche Ausbeuten in OD gelten nur für unmodifizierte Oligos >20mer.
3 Die in nmol angegebenen Ausbeuten stellen eine Beispielrechnung für ein 20mer dar. Für diese Berechnung wurde die folgende Faustformel angewendet: nmol Oligo = OD x 100/Länge des Oligos. Bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 DNA-Basen basiert; sie kann bei Sequenzen mit hohem GC-Gehalt >70% etc. abweichen.
4 Oligos, die länger als 150 DNA-Basen sind, auf Anfrage (wir möchten das geplante Experiment/die Anwendung vorher mit Ihnen besprechen, um das bestmögliche Ergebnis zu gewährleisten)

RNA Ausbeuten

 
Desalted RNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 10 - 30 4 21 6 28 2
0.2 µmol 10 - 504 8 35 10 45 2
1.0 µmol 10 - 504 18 80 22 100 2
15 µmol 10 - 40 400 1'800 800 2'200 3
 
HPLC Purified RNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 10 - 30 1 5 2 10 2
0.2 µmol 10 - 80 3 15 5 25 2
1.0 µmol 13 65 17 85 2
15 µmol 10 - 40 300 1'500 360 1'800 4
 
HPLC Purified & Dialysed RNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 10 - 80 2 10 3 15 4
1.0 µmol 9 45 11 55 4
15 µmol 10 - 40 200 1'000 250 1'250 4
 
PAGE Purified RNA Oligos
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield Average Yield Production Time [wd]
[OD260]2 [nmol]3 [OD260]2 [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 10 - 504 1 5 1 5 2
1.0 µmol 10 - 504 6 30 7 30 2
15 µmol not available

1 Der Synthesemassstab entspricht der Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial).
2 Garantierte und durchschnittliche Ausbeuten in OD gelten nur für unmodifizierte Oligos >20 und <40 Nukleotide.
3 Die in nmol angegebenen Ausbeuten stellen eine Beispielrechnung für ein 20mer dar. Für diese Berechnung wurde folgende Faustformel angewendet: nmol Oligo = OD x 100/Länge des Oligos. Bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 RNA-Basen basiert.