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Click Chemistry

 
 
Die Click Chemistry beschreibt eine thermodynamisch begünstigte Reaktion, die eine quantitative und selektive Verknüpfung von zwei unterschiedlichen Biomolekülen ermöglicht. Genauer gesagt handelt es sich bei der Click-Reaktion um eine Cycloaddition zwischen einem Azid und einer Alkin-Einheit entweder unter kupferkatalysierten oder kupferfreien Reaktionsbedingungen. Die Technologie ist zuverlässig und stabil, was sie zu einer idealen Oligonukleotid-Markierungsmethode macht.

Zu den allgemeinen Vorteilen der Click Chemistry gehören:

  • Reaktion erfolgt in wässriger Lösung und bei Raumtemperatur
  • Stabilität gegenüber H2O, O2 und den meisten organischen Synthesebedingungen
  • Robuster katalytischer Prozess
  • Keine Nebenreaktionen und keine Störung durch funktionelle Gruppen
  • Bemerkenswerter Grad an Spezifität für Synthesen, die eine kovalente Verknüpfung zwischen zwei biochemischen Einheiten erfordern.

Übersicht

Die Click Chemistry ist ein moderner synthetischer Ansatz für den modularen Aufbau komplexerer Moleküle aus "einfacheren" Bausteinen [1,2]. Bei der Click-Reaktion wird eine Azid-funktionalisierte Komponente an einen Alkynyl-funktionalisierten Baustein gekoppelt, um ein "bifunktionelles" Konjugat zu bilden. Da die Click-Chemie mit Biomolekülen in wässriger Umgebung kompatibel ist, eignet sich diese Art der Reaktion besonders gut, um molekulare Sonden an DNA zu binden [3,4]. Der entscheidende Vorteil der Click-Reaktion ist ihre Bioorthogonalität1, da beide Reaktionspartner, das Azid und die Alkin-Gruppe, in natürlichen Systemen nicht vorkommen.

 

Im Zusammenhang mit maßgeschneiderten synthetischen DNA-Oligonukleotiden wird der Click-Ansatz häufig verwendet, um eine Azid-funktionalisierte molekulare Sonde an ein Oligonukleotid zu konjugieren, das einen Alkinylrest enthält (oder umgekehrt).

Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Click-Reaktion sind DNA- und RNA-Oligonukleotide, die spezifisch an mehreren Stellen markiert sind, nun synthetisch zugänglich. Damit hat die Click-Chemie eine Tür zu einer neuen Welt modifizierter Oligonukleotide geöffnet, die bisher praktisch nicht synthetisierbar waren.

Die am häufigsten angewandte Art der Click-Reaktion verwendet Cu(I) als Katalysator (copper assisted cycloaddition; CuAAC). Für Fälle, in denen die Anwesenheit von Kupfer (potenziell) schädlich ist, wurde eine kupferfreie Alternative entwickelt. Um Kupfer in den DNA-Sonden zu vermeiden, wird der reaktivere Alkin-Rest Dibenzocyclooctin (DBCO) für die Click-Reaktion eingesetzt [5-8]. 

Die Bedeutung der Click-Reaktion auf dem Gebiet der Oligonukleotide nimmt weiter zu. Wenn Sie mehr über diese spannende Technologie erfahren möchten, lesen Sie bitte die unten stehenden Referenzen oder die Links in der rechten Spalte.

 

Referenzen:

  1. El-Sagheer AH, Brown T. Chem Soc Rev. Chem. Soc. Rev., 2010,39, 1388-1405
  2. V.V. Rostovtsev, Green, L.G., Fokin, V.V. and Sharpless, K.B., Angew Chem Int Ed, 2002, 41, 2596-2599.
  3. R. Huisgen, Angew Chem Int Ed, 1963, 2, 565-598. 
  4. Y.H. Zhang, et al., Tetrahedron, 2007, 63, 6813-6821. 
  5. I.S. Marks, et al., Bioconjugate Chemistry, 2011, 22, 1259-1263. 
  6. Becer CR, Hoogenboom R, and Schubert US, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 2–11 
  7. J. Gierlich, G. A. Burley, P. M. E. Gramlich, D. M. Hammond, T. Carell, Org. Lett. 2006, 8, 3639-3642. F. Seela, V.  R. Sirivolu, Chem. Biodiversity 2006, 3, 509-514.
  8. P. M. E. Gramlich, S. Warncke, J. Gierlich, T. Carell, Angew. Chem. 2008, 120, 3491 - 3493; Angew. Chem. Int.  Ed. 2008, 47, 3442– 3444.

 

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1 Bioorthogonal ist definiert als: keine Interferenz von in Biomolekülen vorhandenen funktionellen Gruppen mit der gewünschten Reaktion. Es werden also keine Nebenprodukte mit DNA, Peptiden oder anderen Biomolekülen gebildet.

Modifikationen

Type of Modification
Position
Synthesis Scale [µmol]
Purification
5’
3’
Int.
0.04
0.2
1.0
Des
HPLC
PAGE
Azide-dT
 
 
X
 
X
X
 
X
X
3' Alkyne
 
X
   
X
X
 
X
X
5' Azide
X      
X
X
 
X
X
3' Azide
  X    
X
X
 
X
X
5' DBCO
X      
X
X
 
X
X
5' Hexynyl
X      
X
X
 
X
X

Azide-dT
Die Azid-Modifikation von Microsynth verwendet eine funktionelle NHS-Ester-Gruppe, um eine Azid-Einheit an der 5'-, 3'- oder einer beliebigen internen Position in einem Oligo anzubringen. Dieser Azidrest kann anschließend verwendet werden, um Alkin-modifizierte Gruppen durch die Click-Reaktion anzuhängen. Die interne Version dieser Modifikation wird durch eine dT-Base an das Oligo gebunden. Durch den Einbau der internen Version wird ein dT-Nukleotid an dieser Position hinzugefügt. Um das Hinzufügen eines zusätzlichen Nukleotids zu vermeiden, ersetzen Sie ein vorhandenes T-Nukleotid in Ihrer Sequenz durch die gewünschte Modifikation.

3' Alkyne
Die Alkin-Gruppe wird für die kupferunterstützte Cycloaddition-Click-Chemie verwendet.

5' Azide
Die 5'-Azidgruppe wird für die kupferunterstützte Cycloaddition-Click-Chemie verwendet.

3' Azide
Die 3'-Azidgruppe wird für die kupferunterstützte Cycloaddition-Click-Chemie verwendet.

5' DBCO
Das 5' DBCO ist ein kupferfreies Klick-Reagenz auf Cyclooctin-Basis.

5' Hexynyl
Die 5' Hexynyl-Gruppe wird für die kupferunterstützte Cycloaddition-Click-Chemie verwendet. Oligonukleotide, die mit 5'-Hexynyl-Phosphoramidit hergestellt wurden, sind stabil gegenüber Standard-Deprotektionsbedingungen und weisen eine leicht erhöhte Retentionszeit in der RP-HPLC auf.

Wie bestellen

 
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Wichtig: Neue Kunden werden gebeten, ihre Anfrage (info@microsynth.ch) unter Angabe der Sequenz & Modifikationsanforderungen sowie der vorgesehenen Anwendung zu senden. Microsynth wird dann Ihre Anfrage prüfen und Ihnen ein individuelles Angebot unterbreiten, das Ihnen einen sinnvollen und kostengünstigen Syntheseansatz für das gewünschte Biomolekül vorschlägt.